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【蓝耳病防控】基因测序技术在猪蓝耳病防控中

Source:adminAuthor:阿诚 Addtime:2019/03/01 Click:

  3.1 蓝耳病病毒和流感病毒类似,变异很快,甚至比PRRSV的变异更快。如何发现PRRSV的变异,这就需要定期对RT-PCR阳性的产物或克隆产物进行测序,改善福利可以提高猪群的表现 /,分析其序列是否发生变异。长期跟踪测序,可以发现病毒在猪场内部的来源与演变,各个猪场之间是否存在交叉感染,病毒是引种带来还是内部的演变,可以大概推测出新病毒是应用新活苗引入还是通过人员引入等。3.2 蓝耳病序列的变异大小与致病程度没有绝对的必然联系,虽然有时甚至发生1%差异,都会带来PRRS的爆发;但总体上看,一般来说序列分析同源性越高,即变异越小,对猪场的危害也相对较小。假如猪场发生PRRS需要使用疫苗,如何挑选最合适的疫苗,应该对发病猪采集病料进行测序分析,筛选同源性最高的疫苗用于防制。比如A猪场发生问题,根据20110117的测序结果,与疫苗进行比对,可以选择以HuN4-F112和JXA1毒株制成的疫苗进行试用,因为这两个毒株与当时A猪场PRRSV的同源性均在98%以上。3.3后备猪的驯化,尽可能用本场完全相似的PRRSV毒株。目前国内外养猪业通用的方法是用本场血清(含PRRSV)或者用序列相似的活苗驯化后备猪。驯化三个月后,才引入母猪场内,防止驯化期间排毒,引发母猪场出现疾病问题。3.4小区域PRRS的控制与净化方法已经非常明确,也非常有效,但PRRSV的很多机理至今没有搞清楚,因此PRRS还将是养猪业最重要的一个疾病。在机理没有明确的前提下,要想长期控制与净化PRRS,测序与分析工作对猪场的稳定显得十分必要。3.5 蓝耳病的测序工作不单是某个猪场的问题,应该普及到整个省及国家层面上,建议交流与共享各个省市的测序结果,这样分析起来将更有意义。通过同源分析和进化树分析,甚至可以分析某一新病毒的传播流行状况,到底是内部变异通过猪群、空气传播,还是疫苗本身或其他因素造成。在政府国家层面上进行猪PRRS的控制与净化,收效将会更快。59个样品经测序后剪切出ORF5进行比对和进化树分析,发现核苷酸置换率为58%,同源性从94.7%~100%不等,整体分化成两大类,PRRSV表现出明显的区域性和时段性。与市面的疫苗株ch-1a、ch-1R、HuN4-F112、JXA1、Ingelvac ATP和RespPRRS MLV比对,近年来流行的PRRS毒株与HuN4-F112、JXA1比较接近,表明目前仍以变异株为主。在DNAstar软件的应用和分析过程中,得到广西大学谢体三博士和广西兽医研究所马玲的帮助,在此一并致谢! 对A猪场20个PRRSV测序结果剪切出的ORF5片段(603bp)进行比对分析,两两比较同源性从95.5%~100%不等,PRRS病毒的进化树如图1,整体核苷酸置换率为53%,A猪场的PRRSV演变成两大类。测序结果表明A猪场内至少存在2种不同的PRRSV。对2010年8月12日送测序的结果比对分析,发现同源性从96.2%~100%,表明当时7月份采血的发病猪的PRRSV相互间存在差异,可能存在3个毒株,编号30、32和34同源性为100%,为同一毒株;编号31和33同源性为100%,为同一毒株,编号35号与其他的不同,为另一毒株(详见图2)。 【杂谈】都知道死猪了肯定赔!如何核算养猪的经济效益?听场长来给你介绍一... 2.2商品猪场A检测结果与分析为进一步了解PRRSV测序技术的应用,以A猪场为例进行详细分析,A猪场病料的来源见来源于产房弱仔、产房母猪、保育病猪和流产母猪(见表2),表明PRRSV对各阶段猪只都有影响。表2 广西农垦永新畜牧集团A商品猪场2010~2011年样品送检测序情况表 对2011年1月17日送测序的结果比对分析,发现ORF5的同源性在99.5%~100%,PRRSV在ORF5片段上的变异很小(详见图3)。表明去年12月份和2011年1月采集的发病猪很可能是由一个新的毒株引起。 摘要:2010年对公司历年保存的PRRSV阳性血清和部分问题猪经RT-PCR检出阳性血清,先后送样8次共62个样品,成功测序59个,用DNAStar 剪切出完整的ORF5序列,进行基因比对和进化树分析,发现核苷酸置换率为58%,同源性从94.7%~100%不等,整体分化成两大类;PRRSV表现出明显的区域性和时间性,各个商品猪场间的序列均有所差异,不同时间段的样品也有差异。测序结果与目前市面上的疫苗株ch-1a、ch-1R、HuN4-F112、JXA1、Ingelvac ATP和RespPRRS MLV比对,发现公司商品猪场近4年流行的PRRS毒株与HuN4-F112、JXA1比较接近,表明目前流行的PRRSV以变异株为主。在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert(1977)发明的化学降解法。这两种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生A、T、C、G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得DNA序列。DNA测序技术的目的:测定未知序列;确定重组DNA的方向与结构;对突变进行定位和鉴定;比较研究。PCR检测技术在上世纪90年代已经应用在动物疾病的检测中,但由于成本较高,检测量相对较少。2005年后,PCR和RT-PCR技术在养殖动物的疫病检测中开始普及应用。基因测序技术,由于早期成本高,仅限于少数科研院校,近年来随着测序成本的大幅下降,近一两年来国内部分规模养殖场开始应用这项技术,尤其以研究猪蓝耳病病毒的演变进化最为常见,测序技术在PRRS的控制与净化中显示出其独到之处。1.1.1仪器:Takara TP 600、英国UVI凝胶成像系统、Hettich MIKRO 22R冷冻离心机、北京六一电流仪和水平电泳槽、净化操作台等。1.1.2试剂:Taq酶、M-MLV、RNA酶抑制剂、Trizol、DNA Maker等。1.2.3用DNAStar Lasergene 7.1进行序列分析,比对各个样品的测序结果,并制作PRRSV ORF5的演变进化树。2010年公司各商品猪场测序的59个PRRSV阳性样品,剪切出完整的ORF5基因片段(603bp),进行整体ORF5比对,发现核苷酸置换率为58%,两两相互比对,同源性从94.7%~100%不等,整体分化成两大类;PRRSV表现出比较明显的区域性和时间性;各猪场的序列相对都有所不同,不同的时间段检测相对也有所不同。与目前市面上存在的疫苗株ch-1a、ch-1R、HuN4-F112、JXA1、Ingelvac ATP和RespPRRS MLV进行两两比对,发现公司商品场近4年流行的PRRSV毒株与HuN4-F112、JXA1比较接近,说明目前流行的以变异株为主(详见表1)。 2008年20100205发病猪8保育猪-5发病猪9保育猪-5发病猪18保育猪-7发病保育猪22产房母猪4头J222104、J39601、J200802、J010070144头混合样品25后备猪01007014发烧26产房弱仔-14产房第4栋30保育猪-2第3栋发病31保育猪-2第6栋发病32保育猪-2第7栋发病337周龄保育猪-28月季度检测(发病)34保育猪-2第8栋发病359周龄保育猪-28月季度检测(发病)41断奶弱仔-0产房5断奶弱仔43流产母猪424903J4流产母猪51流产母猪J164902、K0110117流产母猪52保育病猪-7保育病猪54产房弱仔-7产房仔猪56产房仔猪-7产房仔猪59保育-7发病保育猪